Establecimiento de una metodología para la embriogénesis somática de la orquídea Dracula vampira

Abstract

Dracula vampira es una especie endémica del Ecuador, muy valorada en el comercio ornamental, la dificultad de germinación y el lento desarrollo de las semillas, dificultan su propagación. La embriogénesis somática, se plantea como una alternativa para su reproducción in vitro, se requieren procesos de: selección de explantes, desinfección, y multiplicación para la obtención de embriones, así como también la caracterización histológica del proceso. El material biológico, para esta investigación fueron secciones foliares y protocormos de Dracula vampira, que se obtuvieron de plantas in vivo e in vitro respectivamente. A las hojas previamente seleccionadas de plantas sanas y vigorosas, se les realizó un lavado con detergente y en el proceso de desinfección se utilizó NaClO en distintas concentraciones (v/v) y tiempos de exposición: 0,5% durante 20 min, 1 y 2% con exposición de 15, 20 y 25 min cada uno. Se procedió a cortar las hojas en porciones de 1cm2 aproximadamente y se colocó 1 explante por tubo con la superficie adaxial en contacto con el medio de cultivo y se incubó en oscuridad. La introducción de los explantes se realizó en medio ½ Murashige & Skoog modificado sin reguladores de crecimiento adicionado con cisteína (25 mgL-1), peptona 1000 (mgL-1), NaH2PO4 (170mgL-1), gelrite (2 gL-1) y sacarosa (20 gL-1) a los 7 días se evaluaron, la contaminación y sobrevivencia de los explantes. Se utilizaron 24 repeticiones por tratamiento y se realizó un análisis descriptivo a través de tablas de contingencia y la prueba de chi cuadrado de Pearson. La exposición de los explantes a NaClO al 0,5%, durante 20 minutos fue la más adecuada para garantizar la supervivencia del tejido, sin embargo, todos los tratamientos resultaron idóneos para el proceso de desinfección. Las secciones foliares no prosperaron en ningún medio suplementado con fitohormonas después de los 28 días y tampoco se observó el crecimiento del callo de cicatrización por lo cual no se consideró viable el uso de este material para la obtención de embriones somáticos. Se utilizaron protocormos como segunda fuente de explante, estos se obtuvieron a partir de la germinación de semillas in vitro y al provenir de un medio estéril no fue necesario un proceso de desinfección para el desarrollo del experimento. Explantes de aproximadamente 4 meses de edad, fueron subcultivados en medio de formación de callo y embriones, en total se utilizaron 9 tratamientos con distintas concentraciones de citoquininas y auxinas (BAP, 2-4D y NAA), un tratamiento control sin reguladores de crecimiento y 12 repeticiones por tratamiento, para el análisis estadístico se aplicó un ANOVA y se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Duncan. El medio basal fue ½ Murashige & Skoog, modificado. El tratamiento 5 que contenía 2-4D (2 mg L-1) y BAP (2 mgL-1) fue el más adecuado, en la prueba de rangos múltiples de Duncan presentó diferencias estadísticamente significativas con varios tratamientos, un mayor valor del peso fresco medio y se observó la presencia de callo embriogénico friable en todos los explantes evaluados. Los explantes se cultivaron en oscuridad durante 56 días, posteriormente se expusieron a un fotoperíodo de 16h luz para estimular el desarrollo de los embriones. En el proceso de embriogénesis somática, se tomaron muestras cada 7 días, desde el subcultivo de los protocormos, hasta la obtención de embriones somáticos, para la observación de tejidos. Se observó que el proceso de embriogénesis somática a partir de protocormos tarda 100 días desde la introducción del protocormo en medio de cultivo y la producción de embriones somáticos inicia en el día 28 observando el crecimiento de las estructuras embrionarias.